COMPONENTES KIT
Tampón de hidratación
 | |
| Tampón de Lisis |
 |
| Tampón de Precipitación proteínas |
EQUIPOS Y REACTIVOS NECESARIOS
 |
| Baño de agua |
 |
| Centrífuga de alta velocidad |
 |
| Microtubos de 1,5 o 2 ml |
 |
| Etanol 70% |
 |
| Isopropanol |
 |
| Lupa |
 |
| Micropipeta |
 |
| Puntas desechables para micropipeta |
 |
| Agitador tipo vórtex |
 |
| Envase de recogida de muestra |
 |
| Pipetas Pasteur |
PROCEDIMIENTO
- Depositamos aproximadamente unos 1,5 ml de saliva en un envase de recogida
Nota: Se recomienda no haber comido nada durante los 30 minutos previos a la toma de muestra.
Muestra saliva - Colocamos 700 μL de saliva en un microtubo de 1,5 o 2 ml (Eppendorf) utilizando una micropipeta con punta desechable.
Microtubo con 700 μL de saliva - Centrifugar durante 90 segundos a 14500 x g.
- Eliminamos el sobrenadante con una pipeta Pasteur sin dañar el pellet blanco visible de células.
Pellet blanco visible de las células - Añadimos 600 μL de Tampón de Lisis.
- Resuspendemos con la micropipeta mediante movimientos arriba y abajo para disolver el pellet de células y lisarlo.
Nota: Es importante resuspender completamente el pellet sin que se observe ningún grumo blanco, ya que sino la cantidad de ADN obtenida será pequeña.
- Incubar durante 10 minutos en el baño de agua. Si es posible, incubar a 37ºC.
- Añadimos 200 μL de Tampón de Precipitación proteínas al lisado celular
- Mezclamos vigorosamente con un agitador tipo vórtex como se muestra en la imagen, a máxima velocidad durante 20-30 segundos.
Ejemplo de agitación de microtubo en agitador tipo vórtex - Centrifugar a 14500 x g durante 5 minutos. Se vuelve a formar un precipitado.
- Preparamos un microtubo de 1,5 o 2 ml que contenga 600 μL de 2-Isopropanol (es lo mismo que el Isopropanol).
- Traspasamos el sobrenadante que contiene el ADN (el del microtubo utilizado en el paso 10) al microtubo que contiene 2-Isopropanol.
- Mezclamos por inversión 50 veces.
Cómo mezclar por inversión - Centrifugar a 14500 x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco.
- Podemos utilizar la lupa para observar el pellet blanco de ADN.
Lupa - Eliminamos el sobrenadante y secamos el tubo de forma breve con papel absorbente.
- Añadimos 600 μL de Etanol 70% para lavar el ADN.
- Centrifugar a 14500 x g durante 1 minuto.
- Eliminamos el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur sin tocar el pellet de ADN.
- Centrifugar a 14500 x g durante 1 minuto.
- Con una micropipeta y punta fina recoger las últimas gotas de etanol residual.
- Invertimos el microtubo en un papel absorbente y dejamos secar durante 8 minutos.
- Añadimos 90 μL de Tampón de Hidratación y resuspendemos con la pipeta.
- Conservamos los microtubos de toda la clase a -18ºC.
- Una semana después, conservamos los microtubos a -80ºC.
Congelador -80ºC
Comentarios
Publicar un comentario