Práctica 8. Cariotipo en sangre periférica 14/01/2019

CARIOTIPO

  • El cariotipo es el conjunto de cromosomas, con sus características, númeroy forma propios de cada especie.
  • Los cromosomas humanos son estructuras altamente organizadas que están en el núcleo de las células y que contienen la información genética del individuo. En la especie humana el número normal de cromosomas es de 46, de los cuales 44 son autosomas y 2 son cromosomas sexuales: XX en las mujeres y XY en los varones.

PRÁCTICA 8. CARIOTIPO EN SANGRE PERIFÉRICA

  • Esta práctica es muy larga, así que ha sido separada en partes pra realizarla en 4 días:
    • Día 1. Preparación de reactivos y siembra de sangre periférica.
    • Día 2. Sacrificio de sangre.
    • Día 3. Bandeo y tinción de los cromosomas.
    • Día 4. Análisis al microscopio.

MATERIALES

Muestras de sangre fresca en Heparina
Ácido acético glaciar

Agua destilada

Colchicina

Fitohemaglutinina

Giemsa

KCl

Medio de cultivo enriquecido

Metanol


Pipetas Pasteur

Pastilla de Buffer pH 6.8

Suero fisiológico

Tripsina

DÍA 1. 14/01/2019

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

a) Solución de KCl

  • Esta solución, se utilizará para el choque hipotónico, y fue preparada por el grupo 1. Necesitamos:
    • 0,56 g KCl.
    • 100 ml de agua destilada.
  • Preparación de 100 ml.
    • Pesamos 0,56 g de KCl.
    • Añadimos agua destilada hasta llegar a 100 ml.
    • Disolvemos.
  • Almacenamiento: a 4ºC, durante no más de 15 días.

b) Fijador Carnoy


  • Fue preparado por el grupo 2. Necesitamos:
    • 50 ml de ácido acético glaciar.
    • 150 ml de metanol.
  • Almacenamiento: a temperatura ambiente.
  • Precauciones:
    • Se realiza en la campana de extracción de gases, evitando su inhalación.
    • Es muy importante evitar el contacto con la piel.

c) Buffer pH 6.8

  • Fue preparado por el grupo 3. Necesitamos:
    • 1 L de agua destilada.
    • Pastilla de buffer pH 6.8.
  • Preparación: disolver la pastilla en 1 L de agua.
  • Almacenamiento: a temperatura ambiente.

d) Tripsina

  • Fue preparada por el grupo 4. Tenemos que mezclar:
    • 1 ml de tripsina (estaba en el congelador).
    • 40 ml de suero fisiológico a temperatura ambiente.
    • 40 ml de buffer pH 6.8.
  • Almacenamiento: a 4ºC, durante no más de 15 días.

e) Giemsa 

  • Fue preparado por el grupo 5. Tenemos que mezclar:
    • 10 ml de giemsa.
    • 90 ml de buffer pH 6.8.
  • Almacenamiento: a temperatura ambiente correctamente cerrado.

SIEMBRA DE SANGRE PERIFÉRICA

  1. El primer paso es extraer sangre. La sangre fue extraída de dos maneras distintas:
    Utilizando lancetas

    Aguja
  2. Debemos descongelar los 6 tubos con medio de cultivo enriquecido. Esto lo hacemos metiéndolo en el baño de agua una hora a 37ºC.
  3. Una vez descongelados, se reparten dos a cada grupo.
  4. Añadimos a cada tubo:
    1. 250 μL de fitohemaglutinina.
    2. 400 μL de sangre. 
  5. Etiquetamos correctamente.
  6. Agitar para mezclar y mantener el tubo en estufa a 37º durante 72 horas.

DÍA 2. 17/01/2019

SACRIFICIO DE SANGRE

  1. Recogemos los tubos del incubador. No debemos olvidar que cada grupo tiene dos tubos, así que todos los pasos se aplican a los dos tubos.
  2. Metemos portaobjetos en un vaso de precipitados con agua y alcohol, los dejamos en el frigorífico para su posterior uso.
  3. Cogemos 3 pipetas Pasteur, y las etiquetamos:
    1. A. Pipeta de trabajo.
    2. B. Pipeta para rellenar.
    3. C. Pipeta limpia.
  4. Añadimos con la micropipeta en el tubo de siembra 250 μL de colchicina. 
  5. Agitar suavemente y dejarlo durante 45 minutos en estufa a 37ºC.
  6. Centrifuamos el tubo 5 minutos a 1000 r.p.m. Cuando finalice, eliminamos el sobrenadante con la pipeta Pasteur de trabajo (A) y echamos el desecho en el bote de residuos.
  7. CHOQUE HIPOTÓNICO. Añadimos con la pipeta Pasteur (B) 5 ml de KCl, provocando que se produzca la lisis celular de eritrocitos y que los linfocitos se hinchen.
    1.  Primero añadimos 1 ml, pipeteamos y mezclamos despacio con la pipeta de trabajo (A).
    2.  Añadimos los otros 4 ml despacio con la pipeta Pasteur (B) a la vez que se va pipeteando con la pipeta de trabajo (A).

      1. Nota: No debemos detenernos en este punto para evitar la lisis celular. Un exceso de tiempo puede provocar que los cromosomas se dispersen y las metafases aparezcan incompletas y mezcladas entre ellas.

  8.  Centrifugamos el tubo 5 minutos a 1000 r.p.m. Cuando finalice, eliminamos el sobrendaante con la pipeta de trabajo (A), y echamos el desecho en el bote de residuos dejando aproximadamente 0,5 ml en el tubo.

  9. Añadimos con la pipeta Pasteur (C) 1 ml de fijador Carnoy. Esta solución se debe resuspender bien con la pipeta (A) muy despacio. Añadimos con la pipeta (C) poco a poco 4 ml de fijador, resuspender con la pipeta (A).
  10.  Centrifugamos 5 minutos a 1000 r.p.m.

    1. NOTA IMPORTANTE: las limpiezas realizadas en los pasos 8 y 9, se hicieron 5 veces en el tubo A, y 3 veces en el tubo B. Hicimos estas repeticiones porque el sobrenadante debe quedar bien limpio y el precipitado debe ser blanco.

  11. Quitamos el sobrenadante con pipeta (A) dejando aproximadamente 0,5 ml. Resuspendemos bien con la pipeta (A).
  12. Se hacen las extensiones sobre los portaobjetos que estaban en el frigorífico, debidamente numerados en la banda mate con rotulador. Echamos 3 gotas con la pipeta (A) a distintas alturas en el centro del porta:
    1. TUBO A. De este tubo obtenemos 2 extensiones:
      1. TUBO A.1. Echamos 3 gotas a 20 centímetros de altura.
      2. TUBO A.2. Echamos 3 gotas a 10 centímetros de altura.
    2. TUBO B. De este tubo obtenemos 2 extensiones:
      1. TUBO B.1. Echamos 3 gotas a 20 centímetros de altura.
      2. TUBO B.2. Echamos 3 gotas a 10 centímetros de altura. 
  13. Dejamos resbalar las gotas inclinando el porta para que extienda por toda la superficie.
  14. Al terminar, colocamos los tubos en una gradilla y la guardamos en la nevera, ya que pueden aguantar unos días.

DÍA 3. 21/01/2019

BANDEO Y TINCIÓN DE LOS CROMOSOMAS

  1. Introducimos el porta en la tripsina, previamente preparada, durante distintos segundos:
    1. PORTAS A1 Y A2: 4 segundos.
    2. PORTAS B1 Y B2: 6 segundos.
      1. Gracias a la tripsinización obtenemos bandas oscuras (adenina y timina) y bandas claras (guanina y citosina).
  2. Se amortigua la acción de la tripsina introduciendo inmediatamente los portas en solución tampón pH 6.8.
  3. Introducimos los portas en la solución preparada con Giemsa durante 2 minutos.

  4. Lavamos los portas con agua, bajo el chorro. Ponemos un barreño en la mesa y lavamos con agua destilada del frasco lavados utilizando paralelas.

  5. Dejamos secar los portas con mucho cuidado para no tocar la superficie donde estén fijados los cromosomas.

DÍA 4. 24/01/2019

ANÁLISIS AL MICROSCOPIO

  • Visualizamos las extensiones con el objetivo 10X, para buscar metafases. Una vez localizada la zona que queremos enfocar, colocamos la misma en el centro del campo de visión, se gira el objetivo y se añade una gota de aceite de inmersión a la preparación. A continuación se cambia al objetivo de 100X y se vuelve a enfocar moviendo solo el micrométrico.
  • Utilizando el microscopio logramos identificar algunos linfocitos y metafases, pero fue muy difícil llegar a diferenciar correctamente los cromosomas. Algunas imágenes:





ACTIVIDADES

  1. ¿En qué tipo de tejidos podemos encontrar células en división mitótica? ¿Por qué se emplea sangre para la realización de la práctica?
    1. En los tejidos que estén formados por células somáticas.
    2. Se emplea sangre porque es un tejido fácil de obtener y permite la obtención de un gran número de células con lo que se obtienen abundantes metafases.
  2. ¿En qué condiciones debe cultivarse la muestra de sangre para poder visualizar los cromosomas?
    1. Debe someterse a cultivo durante 72 horas a 37ºC y al 5% de CO2.
  3. ¿Qué función tiene la colchicina?
    1. Es un inhibidor de la división celular.
  4. ¿Por qué aparecen bandas en el cromosoma después de tratarlo con tripsina?
    1. Porque la adenina y la timina (que forman la zona oscura de las bandas) son más resistentes a la tripsina, mientras que la guanina y citosina son menos resistentes y forman la zona clara.
  5. Para poder detectar una aneuploidía (Trisomía 21, por ejemplo), ¿es necesario hacer un bandeo de los cromosomas?
    1. No, ya que la trisomía 21 se trata de una anomalía cromosómica numérica. En el caso de una anomalía estructural sí es necesario hacer un bandeo, pero en este caso no lo es, ya que para detectar la anomalía solo tenemos que contar el número de cromosomas.

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