Práctica 11. PCR y ELECTROFORESIS 14/02/2019

PCR Y ELECTROFORESIS

  • El proceso de electroforesis consta de varias partes, las hemos dividido en:
    • Preparación del gel de agarosa.
    • PCR.
    • Electroforesis.

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA 14/02/2019

MATERIALES

Molde y topes
FlashBlue

Matraz Erlenmeyer

Agua destilada

Tampón de electroforesis 10X

Agarosa

Peines

PREPARACIÓN DEL MOLDE Y DEL GEL DE AGAROSA

  1. Cogemos el molde para hacer los geles y cerramos los extremos con los topes para que no se salga la agarosa.
  2. Colocamos el peine para formar los pocillos.
  3. Como nuestro tampón de electroforesis es 10X y necesitamos que el tampón sea 1X, le añadimos 1L de agua.
  4. Queremos un gel de 7 x 10 cm, así que:
    1. Pesamos 0,40 gramos de agarosa para que nuestro molde tenga agarosa al 1%.
    2. Añadimos 42 ml de tampón de electroforesis 1X al matraz erlenmeyer.
    3. Añadimos la agarosa y mezclamos para disolver los grumos.
  5. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa para llevar la solución a punto de ebullición, hasta que la solución sea clara sin partículas aparentes.
  6. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC.
  7. Añadimos la solución en el molde y lo dejamos reposar durante unos 30 minutos para que solidifique.
  8. Sacamos los topes del molde y guardamos el gel en la nevera.

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA CON FLASHBLUE

  1. Repetimos los mismos pasos que hemos seguido para preparar el anterior gel de agarosa hasta el punto 6.
  2. Una vez enfriada la solución de agarosa más o menos a 55ºC, añadimos 100 μL de FlashBlue 10X concentrate y mezclamos bien.
  3. Añadimos la solución en el molde y lo dejamos reposar durante unos 30 minutos para que solidifique.
  4. Sacamos los topes del molde y guardamos el gel en la nevera.

PCR 07/03/2019

OBJETIVO

  • El objetivo de este experimento es familiarizarnos con los principios y práctica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) mediante el estudio de la determinación del Rh, utilizando para ello la técnica de la PCR.

COMPONENTES DEL KIT

Tampón de electroforesis concentrado 10X: 100 mL
Agarosa: 1,5 g
MIX PCR 700 μL (conservar a -20ºC)
Control positivo Rh+: 20 μL (conservar a -20ºC)

PROCEDIMIENTO. PCR

  1. El primer paso es realizar la extracción de ADN bucal. Este paso lo realizamos durante el primer trimestre, y conservamos las muestras en el congelador a -80ºC.
  2. Descongelamos las muestras de ADN.
  3. Manteniendo la técnica aséptica en la sala limpia del laboratorio, utilizamos la cabina para trabajar. Introducimos 2,5 μL de ADN en un microtubo. 

    1. Nota: Vamos a realizar la PCR de 4 muestras de ADN por grupo, así que debemos rotularlos correctamente.

  4. Añadimos a cada microtubo 22,50 μL de MIX PCR para alcanzar un volumen total de 25
    μL.
  5. Preparamos los 4 microtubos de ADN.
  6. Además del microtubo con ADN, debemos preparar para cada electroforesis:
    1. Un control negativo de amplificación, colocando 2,5 μL de agua libre de nucleasas en lugar del ADN.
    2. Un control positivo de amplificación, colocando 2,5 μL del control positivo Rh+ en lugar del ADN.
  7. Las puntas utilizadas las desechamos en el vaso de precipitados para desechos.
  8. Realizar el proceso de amplificación, programando:
  9. Ponemos en marcha el termociclador.
  10. Tras terminar la amplificación, el producto puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa..

ELECTROFORESIS 11/03/2019

MATERIALES

Cubeta de electroforesis
Fuente de alimentación
Productos amplificados en el termociclador

Micropipeta y puntas correspondientes

Tampón TAE 10X

Dana Blue

Gel de agarosa previamente preparado

PROCEDIMIENTO

  1. Introducimos el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis.
  2. Llenamos con 250 ml de tampón TAE 1X hasta que sobrepase al gel unos milímetros.
    1. PREPARACIÓN DEL TAMPÓN TAE 1X:
      1. Intentamos medir 100 ml de tampón TAE 10X en una probeta.
      2. Llenamos con agua destilada hasta 1000 ml para conseguir tampón 1X. 
  3. Comenzamos a pipetear en los pocillos siguiendo un orden.

    1. Nota: Pipetamos 8 μL de las cuatro muestras del grupo, pero SOLO PIPETAMOS 5 μL de la escalera, del control positivo y del control negativo.

  4. Cuando hayamos terminado de pipetear cerramos la cubeta.
  5. Conectamos la fuente de alimentación a 150 voltios durante 30 minutos para observar el desplazamiento.
  6. Cuando hayan pasado 30 minutos desconectamos la fuente de alimentación.
  7. Sacamos el gel de la cubeta con MUCHO CUIDADO y lo sumergimos en el colorante previamente preparado durante 10 minutos.
    1. PREPARACIÓN DEL COLORANTE DILUIDO:
      1. Introducimos en una probeta 9,38 ml del colorante.
      2. Completamos con agua destilada hasta alcanzar 125 ml.
  8. Sacamos el gel del cubo con colorante y lo lavamos con agua debajo del grifo.
  9. El gel está listo para ser observado.

RESULTADOS FINALES

  • La observación del gel en el transiluminador no es posible ya que no hemos añadido fluorocromos.
  • Si observamos el gel con un foco de luz podemos observar un desplazamiento del colorante en algunos pocillos, aunque no lo suficiente. El resultado no ha sido muy bueno.
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