Práctica 9. Tinción de cromosomas de células cancerígenas prefijadas 31/01/2019

OBJETIVO

•  El objetivo de esta práctica es utilizar la tinción de Giemsa para examinar el cariotipo de células cancerígenas. 
• En esta práctica las células han sido fijadas en portaobjetos en metafase permitiendo a los estudiantes teñir y observar los cromosomas condensados. Se desarrollará el conocimiento del cariotipo y la asociación de anomalías cromosómicas con enfermedades.

COMPONENTES DEL KIT (conservar a temperatura ambiente)

• Portaobjetos con células fijadas.
  
• Tinción GIEMSA.
•  Medio de Montaje.
• Cubreobjetos.
• Microtubos.
• Micropipetas.

MATERIAL NO SUMINISTRADO

Pinzas de madera

Papel absorbente

Microscopio

Guantes

Agua destilada

DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO

•  Las células utilizadas en este experimento es una línea celular inmortalizada de leucemia mieloide crónica que ha sido crecida en laboratorios durante décadas, contribuyendo a su inestabilidad genómica. Por tanto, estas células presentan un cariotipo anormal, el cromosoma Philadelphia, una segunda translocación entre el cromosoma 15 y 17, y un total de 68 cromosomas.
• Las células son cultivadas por un periodo breve de tiempo en el laboratorio y luego son tratadas con colchicina que inhibe la formación de microtubos y la división celular es detenida en la metafase. Estas células luego son fijadas y adheridas a portaobjetos de microscopio. Y finalmente se prodúcela tinción con Giemsa, una mezcla de colorantes que selectivamente tiñe de azul el ADN permitiendo visualizar los cromosomas al microscopio.

PROCEDIMIENTO

PREPARACIONES PREVIAS

1. Marcar 12 microtubos de la siguiente forma: a) 6 microtubos GIEMSA; b) Medio de montaje.
   
2. Añadir 7 ml de agua destilada al bote con GIEMSA concentrado y mezclar por inversión.
   
3. Dispensar aproximadamente 1 ml de cada reactivo al microtubo correspondiente.
4. Preparar vasos con agua destilada para lavar las preparaciones.
5. Distribuir por grupo
1. Una preparación.
2. Un cubreobjeto.
   
3. Dos micropipetas.
   
4. Agua destilada.
   

TINCIÓN

1.  Añadir 10 gotas o 250 ul de la tinción GIEMSA en el área del portaobjetos que contiene la extensión de células en metafase. Agitar muy suavemente en círculos pequeños de forma que quede cubierto toda el área.
   
   
2.  Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3.  Eliminar la tinción sobrante aspirando con pipeta Pasteur.
   
4.  Sumergir cuidadosamente la preparación en el vaso que contiene el agua destilada durante 30 segundos. Se recomienda colocar el portaobjetos sobre un folio blanco que haga contraste para observar la tinción azul.
5.  Secar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. 

1. Nota: Para eliminar todo el agua, inclinar el portaobjetos para recoger el agua en un extremo y ayudarse con la punta de papel secante.

6.  Utilizando una micropipeta, añadir 1 o 2 gotas de medio de montaje a las células teñidas. 
   
7.  Cuidadosamente colocar un cubreobjetos encima del medio de montaje. Evitar la formación de burbujas. Sihay burbujas presionar muy suavemente para desplazarlas.

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

1.  Utilizamos un microscopio de campo claro. El objetivo de inmersión ayudará en la correcta visión de los cromosomas. Utilizar el objetivo 10x o 20X y buscar un campo bien teñido para localizar las mejores metafases.
2.  Buscar otro diferente campo o células y repetir las observaciones por 4 veces más. 
3.  Conseguimos diferenciar algunas células, pero no logramos ver cromosomas.

ACTIVIDADES 

1.  ¿Cuál es el número normal de cromosomas en las células humanas?¿Son las células normales haploides o diploides?
1.  46 cromosomas diploides (n=23).
2.  ¿Cómo funciona la colchicina en las células y por qué es útil en la metafase? 
1. La colchicina se une a la tubulina e inhibe la formación de los microtúbulos, los cuales son los responsables de la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis. Por tanto, la colchicina detiene la progresión del ciclo celular en la metafase. En este momentos los cromosomas están más condensados y el núcleo ha sido degradado permitiendo la fácil visualización de los cromosomas. 
3.  ¿Porqué sólo algunas células muestran los cromosomas mientras otras mantienen el núcleo intacto? 
1. El ciclo celular de las células tiene un tiempo aproximado de 24 horas, y el tratamiento de la colchicina sólo puede durar algunas horas antes de convertirse tóxico para las células. Por tanto, sólo una proporción de células se pararán en la metafase cuando sean fijadas en el portaobjetos. Estas células mostrarán los cromosomas y las otras se encontrarán en otros estados del ciclo celular y el núcleo intacto. 
4. ¿Por qué crees que hay anomalías cromosómicas severas o letales, mientras que otras anomalías son relativamente suaves?
1.  Algunas anomalías autosómicas incluyendo delecciones o duplicaciones conducen a una concentración no adecuada del producto de los genes. Las células requieren una expresión específica de los niveles de sus proteínas y los cambios en los cromosomas pueden llevar a una alteración en la expresión génica. En el caso de la trisomía del 21 (Síndrome de Down), el incremento de los niveles de proteínas producido por un cromosoma extra es relativamente bien tolerado mientras que otros cambios en otros cromosomas autosómicos son letales. Las delecciones o duplicaciones del cromosoma X conduce a producir sólo algunos efectos negativos ya que sólo existe un cromosoma X activo, debido a esto, un cromosoma X extra es inactivado. 
5. ¿Por qué una trasnlocación balanceada entre 2 cromosomas conduce a individuos sanos? 
1. En una translocación balanceada, partes de un cromosoma es intercambiada pero el material genético no se pierde o duplicado. Frecuentemente, el resultado son individuos sanos sin negativos efectos aunque ciertas translocaciones pueden producir una expresión de los genes baja o aumentada produciendo esto una enfermedad.