Práctica 7. Cultivo de células animales (HIBRIDOMA) 03/12/2018

FASES

  1.  Preparación del medio de cultivo.
  2.  Descongelación.
  3.  Primer cultivo.
  4.  Subcultivos.
  5.  Conteo, cálculo de la concentración y evaluación de la viabilidad celular.
  6.  Expansión.
  7.  Criopreservación.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO 03/12/2018

OBJETIVO

  • El objetivo es preparar el medio de cultivo comercial suplementado con suero fetal bovino (FBS) a utilizar con la línea celular de hibridoma.

MATERIAL Y EQUIPO

  • Medio de cultivo celular DMEM.
  • Suero fetal bovino (FBS).
  • Disoluciones de agentes que mejoran el crecimiento (Hybri-max).
  • Disolución de penicilina-estreptomicina.
  • Disolución de anfotericina B (antibiótico).
  • Pipetas serológicas graduadas de 5, 10 y 25 mL.
  • Auxiliar de macropipeteado.
  • Micropipeta de 100 a 1000 μL y puntas estériles correspondientes.
  • Unidades de filtración de vacío de PES 0,45 ó 0,22 μm.
  • Bomba de vacío y trompa de vacío.
  • Tubos Falcon de 50 mL estériles.
  • Bote de rechazo.
  • Baño termostático.
  • Etanol al 70%.

ENTORNO Y REQUISITOS PREVIOS

  1.  Encender la cabina de flujo laminar con etanol al 70%.
  2.  Mantenerla 5-10 minutos con luz UV antes de trabajar con ella.
  3.  Desinfectar el material con etanol al 70%.
  4.  Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos para evitar posibles contaminaciones.

    1. Nota: si olvidamos algún material fuera de la cabina, un compañero pulveriza etanol al 70% sobre ella e introducimos dicho material en la cabina.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

  • El medio de cultivo fue preparado por el grupo 3.
  •  El primer paso consiste en inactivar el suero fetal bovino. Se inactiva mediante aplicacion de calor: 57°C durante 30 minutos:
    •  Encendemos el baño y dejamos que alcance los 57°C.
    • Introducimos la botella de FBS.

    • Después de 30 minutos, sacamos la botella y apagamos el baño.
  • Para preparar el medio de cultivo, añadimos a 500 mL de medio de cultivo MDEM:
    •  55 mL de FBS.
    •  5 mL de Penicilina.
    •  250 µL de Anfotericina B.
    •  Hybri-max (es un suplemento en polvo) disuelto en 10 mL de FBS (suero fetal bovino).

FILTRACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

  1.  Abrimos la unidad de filtración.
  2.  Conectamos el filtro a la bomba de vacío y la encendemos.
  3.  Vertemos el medio de cultivo en la unidad de filtración, hasta haber filtrado completamente.
  4.  Desconectamos la unidad de filtración de la bomba y la apagamos.
  5.  Quitamos el filtro y cerramos la botella con el medio de cultivo filtrado.
  6.  Rotulamos la botella de medio con el nombre del medio de cultivo, la fecha y el curso.
  7.  Desechar los filtros utilizados.
  8.  Hacemos alícuotas de FBS en tubos de 50 mL para 6 grupos y los metemos en la nevera.

DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS Y PRIMER CULTIVO 03/12/2018

OBJETIVO

  • El objetivo de esta parte es descongelar las células de hibridoma previamente criopreservadas en el congelador de -80°C y cultivarlas en T-flasks.

MATERIALES

  • Baño termostatizado
  • Centrífuga
  • Medio de cultivo DMEM preparado
  • Pipetas serológicas estériles graduadas de 5, 10 o 25 mL
  • Auxiliar de macropipeteado
  • Micropipeta de 100 a 1000 μL y puntas estériles correspondientes
  • Tubos Falcon de 15 mL estériles
  • T-flasks estériles
  • Gradilla para tubos
  • Guantes para criopreservación
  • Etanol 70%
  • Bote de rechazo

REQUISITOS PREVIOS

  1.  Encender la cabina de flujo laminar con etanol al 70%.
  2.  Mantenerla 5-10 minutos con luz UV antes de trabajar con ella.
  3.  Desinfectar el material con etanol al 70%.
  4.  Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos para evitar posibles contaminaciones.

    1. Nota: si olvidamos algún material fuera de la cabina, un compañero pulveriza etanol al 70% sobre ella e introducimos dicho material en la cabina.

  • Antes de descongelar las células debemos:
    • Encender el baño termostatizado hasta alcanzar los 37°C.

DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS

  • Queremos obtener dos T-flasks a partir de cada vial de células descongeladas, así que el protocolo a seguir sería el siguiente:
  1. Sacamos los viales de congelación con células del congelador.
  2.  Debemos tener los viales en la mano (cerrada) durante 1 minuto aproximadamente.
  3.  Introducimos el vial en el baño a 37°C durante 2 minutos (hasta que se descongele), sin sumergirlo por completo.
  4.  Rociamos con etanol al 70% el vial antes de introducirlo a la cabina de flujo.
  5.  Añadimos al vial de congelación 1 mL de medio calentado previamente a 37°C y lo transferimos a un tubo estéril de 15 mL.

  • Continuamos con la práctica el 10/12/2018. 

  1. Centrifugamos (80xg. 8 minutos) e introducimos los tubos en la cabina de flujo.
  2. Con una pipeta Pasteur quitamos el sobrenadante.


    Pellet
  3. Añadimos al tubo en el que se encuentra al pellet 4 mL de medio de cultivo y resuspendemos.

  4.  Tomamos 2 T-flasks y ponemos 3 mL de medio de cultivo calentado previamente a 37°C en cada uno de ellos.
  5.  Repartimos los 4 mL con las células resuspendidas en ambos T-flasks debidamente rotulados (2 mL en cada uno) para obtener un volumen final de 5 mL.
  6.  Introducimos los cultivos en el incubador.
  7.  Los distintos medios sobrantes los neutralizamos con lejía al 50%.

SUBCULTIVO  13/12/18

OBJETIVO

  • El objetivo de esta parte es subcultivar las células del primer cultivo en medio fresco para potenciar su crecimiento.

MATERIALES

  • Baño termostatizado
  • Centrífuga
  • Medio de cultivo DMEM preparado
  • Pipetas serológicas estériles graduadas de 5, 10 o 25 mL
  • Auxiliar de macropipeteado
  • Micropipeta de 100 a 1000 μL y puntas estériles correspondientes
  • Tubos Falcon de 15 mL estériles
  • T-flasks estériles
  • Gradilla para tubos
  • Etanol 70%
  • Bote de rechazo

REQUISITOS PREVIOS

  1.  Encender la cabina de flujo laminar con etanol al 70%.
  2.  Mantenerla 5-10 minutos con luz UV antes de trabajar con ella.
  3.  Desinfectar el material con etanol al 70%.
  4.  Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos para evitar posibles contaminaciones.

    1. Nota: si olvidamos algún material fuera de la cabina, un compañero pulveriza etanol al 70% sobre ella e introducimos dicho material en la cabina.

PROCEDIMIENTO

  1. Tomamos todo el contenido de cada T-flask y lo transferimos a tubos Falcon de 15 mL.


  2. Centrifugamos (80xg. 8 minutos) e introducimos los tubos en la cabina de flujo.
  3. Con una pipeta Pasteur quitamos el sobrenadante de cada tubo.
  4. Añadimos 5 mL de medio de cultivo a cada tubo donde se encuentra el pellet, resuspendemos y lo trasladamos a un nuevo T-flask limpio y debidamente rotulado (tenemos 4 T-flasks nuevos).
    Añadimos 5 mL de medio de cultivo
  5. Introducimos los cultivos en el incubador.

CONTEO, CONCENTRACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR 17/12/2018

OBJETIVO

  • El objetivo de esta parte es calcular los parámetros de concentración y viabilidad de un cutlivo celular.

MATERIALES

  • Cámara de Neubauer

  • Contador manual
  • Disolución al 0,4% de Azul Tripán
  • Microscopio óptico invertido
  • Micropipetas de 10 a 100 µL y puntas estériles correspondientes
  • Tubos Eppendorf de 1,5 mL
  • Gradilla para tubos
  • Etanol 70%
  • Bote de rechazo

REQUISITOS PREVIOS

  1.  Encender la cabina de flujo laminar con etanol al 70%.
  2.  Mantenerla 5-10 minutos con luz UV antes de trabajar con ella.
  3.  Desinfectar el material con etanol al 70%.
  4.  Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar las manos sin cerrar botellas o tubos para evitar posibles contaminaciones.

    1. Nota: si olvidamos algún material fuera de la cabina, un compañero pulveriza etanol al 70% sobre ella e introducimos dicho material en la cabina.

PROCEDIMIENTO

  1.  Debemos mover el cultivo a caracterizar para homogeneizarlo. 

    1. Nota: utilizamos el cultivo del grupo 1, ya que en nuestros cultivos se observaba muy poca viabilidad.

  2.  Tomamos 20 µL de muestra de cultivo y se añaden a un tubo Eppendorf.
  3.  Añadimos al tubo Eppendorf igual cantidad de Azul Tripán (20 µL).
  4.  Resuspendemos un par de veces con cuidado para no deteriorar las células.
    20 µL de azul tripán + 20 µL de muestra de cultivo = 40 µL
  • Realizamos el recuento en cámara de Neubauer.
  1.  Situamos la cámara de Neubauer en posición horizontal sobre la mesa.
  2.  Con una micropipeta tomamos 10 µL de la muestra que está contenida en el tubo Eppendorf.
  3.  Colocamos la punta de la micropipeta en el extremo de la cámara de Neubauer e introducimos la muestra desde el lateral, que entra por capilaridad.
  4. Colocamos la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio.
  5. Enfocamos el microscopio hasta que podamos ver nítidas las células mirando por el binocular y buscamos el primer cuadro en el que vaya a realizarse el recuento. En la cámara Neubauer vamos a contar los 4 cuadros grandes de los extremos.
  6. Debemos contar las células viables (sin teñir) y las células no viables (teñidas de azul) y anotamos los resultados.

RESULTADOS

  • Tras el contaje de células, obtenemos:
  • La concentración celular viene definida por la ecuación:
  • La viabilidad celular, viene definida por la ecuación:
  • En el cultivo hay muy poca viabilidad celular, esto puede deberse a que la incubadora de CO2 no funcionaba correctamente.

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