Práctica 13. Southern Blot 04/04/2019

OBJETIVO

  • El objetivo de esta práctica es aprender a aplizar las técnicas de hibridación, más como la Southern blot. Esta técnica se trata de una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separador por electroforesis en gel y transferirlos a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
  • En este caso, realizamos una prueba de paternidad.

ESQUEMA

  1. Digestión enzimática.
  2.  Electroforesis en gel.
  3. Transferencia del ADN a la membrana.
    1. Desnaturalización.
    2. Transferencia.
    3. Anclaje del ADN a la membrana.
  4. Hibridación.
  5. Revelado.

MATERIALES

  • Muestras de ADN para electroforesis.
  • UltraSpec-AgarosaTM.
  • Buffer electroforesis (50X).
  • Pipeta 1 ml.
  • Probleta de 100 ml.
  • Portapipetas.
  • Cortsar membrna de nylon (7x7 cm).
  • Cortar papel Wachman (7x7 cm).
  • Bote de solución de tinte para ADN.

PROCEDIMIENTO

04/04/2019

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA

MATERIALES

Molde y topes
FlashBlue

Matraz Erlenmeyer

Agua destilada

Tampón de electroforesis 10X

Agarosa

Peines

PREPARACIÓN DEL MOLDE Y DEL GEL DE AGAROSA

  1. Cogemos el molde para hacer los geles y cerramos los extremos con los topes para que no se salga la agarosa.
  2. Colocamos el peine para formar los pocillos.
  3. Como nuestro tampón de electroforesis es 10X y necesitamos que el tampón sea 1X, le añadimos 1L de agua.
  4. Queremos un gel de 7 x 10 cm, así que:
    1. Pesamos 0,40 gramos de agarosa para que nuestro molde tenga agarosa al 1%.
    2. Añadimos 42 ml de tampón de electroforesis 1X al matraz erlenmeyer.
    3. Añadimos la agarosa y mezclamos para disolver los grumos.
  5. Calentamos la mezcla en el microondas para disolver la agarosa para llevar la solución a punto de ebullición, hasta que la solución sea clara sin partículas aparentes.
  6. Enfriar la solución de agarosa más o menos a 55ºC.
  7. Añadimos la solución en el molde y lo dejamos reposar durante unos 30 minutos para que solidifique.
  8. Sacamos los topes del molde y guardamos el gel en la nevera.

ELECTROFORESIS

  1.  Preparamos un vaso de precipitado con agua caliente a 65ºC para calentar los tubos que contienen al ADN antes de la carga del gel.
  2. Calentamos las muestras de ADN A-E durante dos minutos a 65ºC.
  3. Cargamos cada muestra en tubos A-E en pozos por orden consecutivo. La cantidad de la muestra: 35-38 μL.
  4. Programamos la electroforesis a 150 V durante unos 35 minutos.

TRANSFERENCIA DEL ADN A LA MEMBRANA

 DESNATURALIZACIÓN

  1. Después de la electroforesis, depuramos el gel de agarosa colocándolo en una bandeja que contenga 100 ml o 0,25 N de HCl.
  2. Remojamos el gel de agarosa durante 15 minutos en 100 ml de Solución desnaturalizadora de ADN (0,5M NaOH / 0,6 M de NaCl). 
  3. En una segunda solución desnaturalizadora de ADN de 100 ml, continuamos remojando el gel durante 15 minutos.

05/04/2019

TRANSFERENCIA 

  1. Colocamos una hoja de papel de plástico sobre una superficie plana.
  2. Quitamos el gel de la bandeja y lo colocamos boca abajo en la envoltura de plástico. Invirtiendo el gel colocamos la superficie boca arriba para entrar en contacto con la membrana.
  3. Recortamos la membrana de nylon según el tamaño del gel.
  4. Recogemos la membrana en los bordes con dos pinzas limpias. Doblamos liugeramente la membrana en el medio y poco a poco humedecemos en la solución de ADN desnaturalizante.
  5. Sumergimos la membrana durante 5 minutos hasta que esté en el fondo saturado con solución de desnaturalización de ADN.
  6. Recortamos y colocamos el papel de filtro en la parte superior de la membrana. Eliminamos las burbujas con ayuda de una pipeta. Colocamos papel sobre la membrana y, con ayuda de un peso eliminamos el exceso de humedad.

  7. Dejamos reposar unos días con peso encima.

08/04/2019

DETECCIÓN DEL ADN

  1. Extraemos el gel de la membrana.
  2. Colocamos la membrana sobre papel de filtro con la cara que contiene el ADN hacia arriba.
  3. Etiquetamos con el número del grupo.
  4. Colocamos la membrana entre dos hojas de papel de filtro y lo dejamos en la incubadora durante 30 minutos.

  5. Colocamos la membrana con el lado del ADN hacia arriba en 100 ml de diluido Solución azul Blot.
  6. Remojamos la membrana a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
  7. Retiramos la mmebrana con una pinza y enjuagamos en 200 ml de agua destilada.
  8. Cambiamos el agua destilada 3 o 4 veces, hasta que observamos claramente las bandas de ADN.

RESULTADOS

  • En el pocillo 1 no logramos visualizarla.
  • En el pocillo 2 sí logramos visualizarla. 
  • En el pocillo 3 sí logramos visualizarla. 
  • En el pocillo 4 sí logramos visualizarla. 
  • En el pocillo 5 no logramos visualizarla.

ACTIVIDADES 

  1. ¿Por qué los diferentes individuos, tales como los hermanos tienen enzimas de restricción distintos a reconocimientos de sitios?
    1. Porque se producen fragmentos que no pueden ser separados.
  2. ¿Cuál es la función de las sondas en el análisis de ADN de paternidad?
    1. Las sondas se utilizan para determinar los lugares de restricción.
  3. ¿Por qué hay más de una sonda de locus único utilizado en una prueba de ADN de paternidad real?
    1. Porque las sondas se utilizan par asegurar que la prueba puede determinar las diferencias entre los individuos estudiados.
  4. ¿Podemos no utilizar sondas en esta simulación de paternidad de ADN y seguir obteniendo resultados?
    1. Sí.

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